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    ELISA試劑盒系統實驗邊緣效應問題

    發布時間: 2019-01-21  點擊次數: 164次

        包被原的性質很重要,蛋白濃度,是否降解,這關系到你做出的抗體可不可以被其識別,所以保留抗原很重要,ELISA試劑盒做重組蛋白時,師兄都嚴格警告一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。封鎖就是讓大量不相關的蛋白質充填這些曠地空閑,從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。但有時因為試驗的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。

        常用封鎖劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉,可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。詳細的試驗還要有堅固的理論外也要實踐,看一下可不可以應用到自己試驗當中去。但選用什么,要依據試驗詳細來實踐。應留意以下原理:ELISA試劑盒因為蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的,靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用,這種物理吸附長短特異性的,受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響,大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。小分子必需依賴和大的蛋白載體偶聯后才能固定在固相載體上。還有有的包被原可能不是蛋白,對于生物素和脂類物質或小分子物質我們要事先對其改造再加以包被,親和素生物素:先親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,這種包被方法平均、牢固,已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

        我們在使用ELISA試劑盒96孔板的實驗測定的時候,常發現有“邊緣效應",也就是外周孔顯色較中心孔深。經研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體,在實驗室的常規ELISA測定中,將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱,板也升溫時,在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時,將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃),就可以很容易地排除“邊緣效應",并且可提高測定的重復性。 
        還有就是在實驗中,必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。提醒注意:加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產生氣泡。ELISA試劑盒太快的話無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區,易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。所以,有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性,下次測定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

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